En los últimos años se han encontrado
pruebas de que los macrófagos activados de manera aberrante están implicados en
enfermedades psiquiátricas, depresión, síndrome metabólico, diabetes tipo 2,
arteriosclerosis y enfermedades cardiovasculares. Se cree que las citoquinas
producidas por estos macrófagos activados alteran el crecimiento normal y la
función de los circuitos neuronales importantes en el cerebro. Además se han encontrado
niveles elevados de citoquinas pro-inflamatorias en el suero de pacientes
psiquiátricos. Los pacientes psiquiátricos a menudo sufren de síndrome metabólico
(SM) y diabetes tipo 2 (DT2). Es bien aceptado que los macrófagos activados de
manera aberrante, en particular aquellos en el tejido adiposo de los pacientes
con síndrome metabólico, secretan citoquinas pro-inflamatorias que inducen
resistencia a la insulina que conduce a la diabetes tipo 2.
Los estudios en Ecuador son
limitados, sin embargo, muestran diferentes patrones de los factores de
crecimiento derivados de macrófagos y citoquinas en el desarrollo de la
hipercolesterolemia y diabetes tipo 2, además
indican que los estudios epidemiológicos más grandes ahora se requieren para
medir la prevalencia del síndrome metabólico en la población general y sus
consecuencias para el estado pro-inflamatorio, activación de monocitos/macrófagos
y bienestar somático (cardiovascular) y mental (depresión).
La bibliografía sobre la
prevalencia de diabetes y síndrome metabólico (SM) en Ecuador es escasa. Hay
indicios de que tanto el síndrome metabólico y la diabetes tipo 2 son más
prevalentes en poblaciones ecuatorianas,
en particular población indígena. De tal manera que esto constituye un problema
grave y costoso en la salud en Ecuador. Por tal razón, para iniciar estas
investigaciones es necesario estandarizar el método de obtención de macrófagos
en sangre periférica, a fin de que sea posible en futuros estudios realizar pruebas
sobre expresión genética, necesarias para el estudio de distintas enfermedades.
A partir de este problema se procedió a seguir en un inicio el siguiente protocolo:
METODOLOGIA
Muestras de Sangre de
Pacientes con DT2 y LADA
Se tomaran 5 muestras, tomando en
cuenta parámetros clínicos generales, estrés de diabetes, estrés cardiovascular
y otras complicaciones. Las muestras de sangre se tendrán en tubos de coagulación
para la preparación de suero y en tubos de heparina sódica de células
mononucleares de sangre periférica (PBMC). El suero y PBMC serán congelados y
almacenados.
A continuación se muestra el procedimiento
para la preparación y aislamiento de células mononucleares humanas purificadas
a partir de sangre periférica.
Aislamiento de células mononucleares por centrifugación en gradiente de
densidad Ficoll-Hypaque
Extraer
10 mL de sangre periférica en tubos con anticoagulante EDTA.
Añadir
3 mL de Ficoll en un nuevo tubo Falcon (girar el tubo de forma que las
paredes queden impregnadas con Ficoll)
Agregar sangre colocando el tubo con Ficoll en un ángulo de 45° y enderezarlo
poco a poco.
Centrifugar
a 2500 rpm por 20 minutos a 18°C.
Se obtendrá:
Remover
la capa superior que contiene plaquetas y plasma.
Recuperar
la nube de mononucleares en un nuevo tubo de con la ayuda de una pipeta de 1 mL, realizando movimientos circulares.
Añadir
3 veces el volumen obtenido de PBS y centrifugar a 1800 rpm por 5 minutos a
18-20°C, con valores de aceleración de nueve (9) y frenado nueve (9).
Retirar
el sobrenadante.
Colocar solución de lisis de eritrocitos durante 5 minutos, llenar el tubo con
PBS y centrifugar a 1600 rpm por 5 minutos a 18-20°C, con valores de
aceleración de nueve (9) y frenado nueve (9).
Repetir
el paso anterior (opcional).
Resuspender
el pellet en medio RPMI de acuerdo a la dilución que se desee realizar.
Tomar medio que contiene las células y homogenizar con azul de
tripán.
Contar
las células con ayuda de la cámara de Neubauer a través del microscopio.
Completar
5 mL de medio RPMI y colocar en un flask de 25 cm2.
Incubar
el medio a 37°C y 5% de CO2.
Monitorear el cultivo cada 24 horas a través del
microscopio invertido.
RESULTADOS
Las células obtenidas fueron observadas bajo el microscopio invertido. Los resultados de mononucleares se muestran en las siguientes imágenes.
Mononucleares. Día 0. 40x
Mononucleares. Día 0. 40x
